憑借著高靈敏度以及精準(zhǔn)定量特性的熒光定量檢測試劑盒，已然成為實(shí)驗(yàn)室日常檢測里的重要工具。許多初次接觸這類試劑盒的操作人員，常常會(huì)對實(shí)驗(yàn)流程感到困惑。對于結(jié)果分析也會(huì)感到困惑。對于常見問題同樣會(huì)感到困惑。本文將會(huì)結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)地梳理使用熒光定量檢測試劑盒的關(guān)鍵要點(diǎn)。

熒光定量檢測原理是什么

熒光定量檢測的關(guān)鍵之處在于借助熒光信號的改變?nèi)プ粉櫡磻?yīng)的進(jìn)程，試劑盒里一般含有熒光染料或者熒光探針，一旦目標(biāo)分子存在，熒光信號會(huì)伴隨反應(yīng)的進(jìn)行而增強(qiáng)，憑借實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度，儀器能夠記錄每個(gè)循環(huán)的熒光值，進(jìn)而生成擴(kuò)增曲線，操作者要明白Ct值的意義，它意味著熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，Ct值跟初始模板量呈現(xiàn)反比關(guān)系，把握了這個(gè)基礎(chǔ)原理，后續(xù)的數(shù)據(jù)分析才會(huì)更為順利。

試劑盒儲(chǔ)存與操作規(guī)范

從收到試劑盒之日起，就得嚴(yán)格依照說明書來保存。熒光定量檢測試劑盒里的酶類，一般需要在-20℃進(jìn)行冷凍保存，而緩沖液以及引物探針，則建議在4℃避光存放。若是反復(fù)凍融，會(huì)嚴(yán)重影響試劑活性，所以未用完的組分應(yīng)當(dāng)進(jìn)行分裝保存。在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，務(wù)必要使用無核酸酶的耗材，加樣的時(shí)候要避免產(chǎn)生氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)干擾熒光信號的采集。每一次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置無模板對照，用來監(jiān)測是否存在污染，這一步驟常常被忽視但卻至關(guān)重要。

結(jié)果判斷與數(shù)據(jù)解讀

當(dāng)拿到擴(kuò)增曲線之后，首先要去觀察對照孔究竟是否正常，陰性對照是不應(yīng)該出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長情況的，陽性對照的Ct值應(yīng)當(dāng)是處于預(yù)期范圍之內(nèi)的，對于樣本結(jié)果的這類判讀，是需要通過結(jié)合擴(kuò)增曲線形態(tài)以及Ct值來共同進(jìn)行分析的，典型的陽性樣本曲線是應(yīng)該呈現(xiàn)出明顯的S型的，并且Ct值是小于設(shè)定閾值的，要是曲線呈現(xiàn)出鋸齒狀或者起峰過低，這可能是由模板濃度過低、儀器光路問題或者試劑降解造成的，對于處在臨界值的樣本，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行確認(rèn)，不要輕易就下結(jié)論。

常見問題如何排查

在使用熒光定量檢測試劑盒之際，遇見到的最為頻繁的問題便是擴(kuò)增曲線異常。要是曲線出現(xiàn)翹尾或者下滑這種狀況，首先得去查看反應(yīng)管是不是存在泄漏現(xiàn)象，管蓋是不是蓋得嚴(yán)實(shí)。當(dāng)出現(xiàn)多峰或者雜峰的時(shí)候，這就表明可能存有引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增的情況，此時(shí)需要對退火溫度予以優(yōu)化或者重新設(shè)計(jì)引物。復(fù)孔重復(fù)性差一般和加樣誤差存在關(guān)聯(lián)，在使用預(yù)混液的時(shí)候一定要充分進(jìn)行混勻才行。要是批次間差異比較大，這種情形下建議對試劑盒開展批間驗(yàn)證，以此來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具備穩(wěn)定性以及可比性。

你于最近時(shí)段內(nèi)在運(yùn)用熒光定量檢測試劑盒之際碰到過什么樣棘手的問題呀，而又是通過怎樣的方式去解決的呢？