通用RT-PCR試劑盒使用指南：從選型到實(shí)驗(yàn)避坑

實(shí)驗(yàn)室里，分子生物學(xué)所用的通用RT - PCR試劑盒，是用于RNA定量檢測(cè)的基礎(chǔ)工具。它和傳統(tǒng)試劑盒不一樣，傳統(tǒng)的是針對(duì)特定物種或特定儀器設(shè)計(jì)的。而通用型產(chǎn)品突出的是，對(duì)不同來源的樣本，以及不同品牌的熒光定量?jī)x器，都有廣泛的適配性。并且，它還保留著逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量擴(kuò)增這兩步核心反應(yīng)。要正確選用和操作這類產(chǎn)品，關(guān)鍵就在于理解“通用”這兩個(gè)字的實(shí)際含義。

通用RT-PCR試劑盒與普通試劑盒有何不同

普通的RT-PCR試劑盒常常是朝著特定的樣本類型或者特定品牌的儀器去優(yōu)化反應(yīng)體系的，然而通用試劑盒在進(jìn)行設(shè)計(jì)之際是考慮到了更多樣化的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的。其核心的區(qū)別在于“兼容性”，其一，反應(yīng)緩沖液是經(jīng)過優(yōu)化的以使能夠適應(yīng)不同來源RNA模板里抑制劑含量的波動(dòng)，其二，熒光染料或者探針的適配性更寬從而能與市面上主流定量PCR儀的檢測(cè)通道相匹配。抉擇通用型產(chǎn)品，能夠削減實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備多款專用試劑所帶來的管理成本。

選購?fù)ㄓ肦T-PCR試劑盒要關(guān)注哪些參數(shù)

選購之際，首要予以關(guān)注的乃是靈敏度以及線性范圍。說明書一般而言會(huì)標(biāo)明最低檢測(cè)限以及動(dòng)態(tài)范圍，而這無疑決定了試劑盒可不可以檢測(cè)到低豐度目標(biāo)。其次呢便是儀器兼容性列表，要去確認(rèn)產(chǎn)品明確地支持您實(shí)驗(yàn)室所使用的定量 PCR 儀型號(hào)。儲(chǔ)存條件以及有效期同樣是至關(guān)重要的，部分通用試劑盒會(huì)把酶與緩沖液分開進(jìn)行包裝以便提升穩(wěn)定性，需要確認(rèn)冷鏈運(yùn)輸是不是完整。除此之外，要留意產(chǎn)品是不是提供預(yù)混液形式，這能夠極大地簡(jiǎn)化加樣步驟并且降低交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

使用通用RT-PCR試劑盒的關(guān)鍵步驟

于操作環(huán)節(jié)里頭，樣本RNA的純度以及完整性屬于第一道關(guān)卡。通用試劑盒雖說對(duì)抑制劑具備一定耐受性，然而A260/A280比值偏離1.8 - 2.0范圍依舊有能夠影響擴(kuò)增效率的可能性。在反應(yīng)體系進(jìn)行配制時(shí)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格去遵循說明書所推薦的比例，特別要留意逆轉(zhuǎn)錄步驟跟擴(kuò)增步驟的試劑加樣順序。在程序設(shè)置這一方面，退火溫度建議首先按照說明書的推薦值來運(yùn)行，要是出現(xiàn)非特異性條帶再借助梯度PCR進(jìn)行微調(diào)。全程運(yùn)用帶濾芯的槍頭，在獨(dú)立區(qū)域完成加樣，防止氣溶膠污染。

通用RT-PCR試劑盒常見問題如何排查

要是擴(kuò)增曲線沒起峰或者 Ct 值偏大，就應(yīng)該優(yōu)先去檢查 RNA 是不是發(fā)生降解，或者看逆轉(zhuǎn)錄步驟有沒有被遺漏。當(dāng)熔解曲線出現(xiàn)雙峰時(shí)，一般意味著引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增，這種情況下可以試著提高退火溫度，或者重新去設(shè)計(jì)引物。要是復(fù)孔間重復(fù)性差，大多是因?yàn)榧訕诱`差，又或者是模板沒有混勻造成的，建議在配制反應(yīng)預(yù)混液的時(shí)候，增加渦旋震蕩步驟并且進(jìn)行短暫離心。倘若儀器報(bào)錯(cuò)“無熒光信號(hào)”，那就需要確認(rèn) ROX 參比染料類型是不是和儀器相匹配，部分通用試劑盒提供了無 ROX 和含 ROX 兩種不同版本可供選擇。