ELISA試劑盒屬基礎(chǔ)科研領(lǐng)域常用檢測(cè)工具，其結(jié)果準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，會(huì)直接對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性產(chǎn)生影響。于實(shí)際操作里，好多實(shí)驗(yàn)人員常碰到背景高、重復(fù)性差等狀況，實(shí)際上這些大多是因?qū)Σ僮骷?xì)節(jié)把控存在欠缺。結(jié)合累積多年的技術(shù)支撐經(jīng)驗(yàn)，我來(lái)講講怎樣把ELISA試劑盒用好——讓每次實(shí)驗(yàn)都能獲取可信數(shù)據(jù)。

樣本處理需要注意什么

決定 ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的首要環(huán)節(jié)，是樣本的收集與保存。不管是細(xì)胞上清、組織勻漿或者血清樣本，采集之后都應(yīng)馬上進(jìn)行處理，或者按照規(guī)定條件予以保存，老是反復(fù)凍融會(huì)極大程度降低目標(biāo)物活性。提議把樣本分裝起來(lái)保存，防止整管反復(fù)進(jìn)行使用。對(duì)于那些有著粘稠特性的樣本或者包含顆粒物的樣本，在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)之前一定要離心獲取上清液，避免顆粒物吸附在酶標(biāo)板上面導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性顯色。

加樣孵育如何更精準(zhǔn)

實(shí)施加樣操作，看起來(lái)好像挺簡(jiǎn)單，然而實(shí)際上卻是對(duì)ELISA試劑盒重復(fù)性造成影響的關(guān)鍵要點(diǎn)之處。進(jìn)行加樣操作時(shí)，槍頭應(yīng)當(dāng)垂直且懸空著放入到孔底，這樣做是為了防止接觸孔內(nèi)液體進(jìn)而產(chǎn)生氣泡。對(duì)于所有的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本而言，建議都要去做復(fù)孔，加樣的順序保持一樣，以此來(lái)保證每個(gè)孔的孵育時(shí)間是相同的。在孵育的過(guò)程當(dāng)中，封閉酶標(biāo)板蓋能夠有效地防止邊緣效應(yīng)的出現(xiàn)，恒溫箱的溫度波動(dòng)需要控制在±1℃范圍以?xún)?nèi)，因?yàn)闇囟炔痪鶆驎?huì)直接對(duì)酶促反應(yīng)速率產(chǎn)生影響。

洗滌環(huán)節(jié)最易被忽略

去除未結(jié)合物質(zhì)、降低背景信號(hào)的核心操作是洗滌步驟，洗板時(shí)，洗液充滿(mǎn)孔底后要立即吸干，重復(fù)三至五次，每次浸泡約三十秒，手工洗板要留意力度均勻，防止洗液濺出致使孔間交叉發(fā)生污染，使用洗板機(jī)時(shí)，要定期校準(zhǔn)吸液針位置以及吸液量，殘留洗液過(guò)多會(huì)稀釋后續(xù)加入的酶結(jié)合物，造成信號(hào)值整體偏低。

信號(hào)檢測(cè)前必須確認(rèn)

顯色反應(yīng)的時(shí)間得依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格把控，要是顯色過(guò)淺那就可以適當(dāng)延長(zhǎng)些，不過(guò)同批實(shí)驗(yàn)的所有孔都必須保持一樣，終止液加進(jìn)去之后，液體顏色會(huì)從藍(lán)變成黃，應(yīng)該在15分鐘內(nèi)完成讀數(shù)，酶標(biāo)儀在使用之前先預(yù)熱穩(wěn)定好，選用正確的雙波長(zhǎng)檢測(cè)模式，主波長(zhǎng)跟參比波長(zhǎng)的組合能夠有效校正板底劃痕或者液體折射所帶來(lái)的干擾，數(shù)據(jù)讀取完之后，觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值，要是低于0.99，就得排查實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中的異常點(diǎn)。

你于運(yùn)用ELISA試劑盒之際，碰到過(guò)哪一種最為棘手難以處理的異常結(jié)果，究竟是那標(biāo)準(zhǔn)曲線無(wú)法呈現(xiàn)線性，還是樣本孔的背景偏高呢？