原代細(xì)胞分離方法

常采用酶消化法以及組織塊貼壁法，從動(dòng)物或者人體組織里分離出原代細(xì)胞，酶消化法適宜于軟組織，像肝臟或者腎臟，于37度水浴之中運(yùn)用膠原酶或者胰蛋白酶實(shí)施溫和消化，每隔5分鐘搖晃一回，借助鏡下觀察細(xì)胞脫落狀況，組織塊貼壁法則適宜纖維組織，把組織剪成1立方毫米的小塊，均勻地貼于培養(yǎng)瓶底面，添加少量培養(yǎng)液之后倒置培養(yǎng)，等細(xì)胞遷出后再翻轉(zhuǎn)，分離過(guò)程得留意無(wú)菌操作，防止污染，與此同時(shí)控制消化時(shí)間，過(guò)度消化會(huì)損害細(xì)胞活性。

原代細(xì)胞培養(yǎng)難點(diǎn)

難點(diǎn)最大的原代細(xì)胞培養(yǎng)，在于細(xì)胞增殖能力存在著有限的情況，通常而言僅僅能夠傳代幾次，并且對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有著苛刻的要求。培養(yǎng)液需要添加10%至20%的胎牛血清，還要額外補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，像是表皮生長(zhǎng)因子或者成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。另外，原代細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化十分敏感，溫度波動(dòng)超出0.5度或者pH值偏離7.2至7.4的范圍，都會(huì)致使細(xì)胞脫落或者死亡。建議使用專用培養(yǎng)箱，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，不過(guò)要盡量減少開(kāi)箱的次數(shù)，防止溫度濕度出現(xiàn)突變。

原代細(xì)胞傳代技巧

那個(gè)傳代的時(shí)機(jī)可是非常關(guān)鍵的，一旦細(xì)胞的融合度達(dá)到了80%直至90%的時(shí)候，那就得馬上及時(shí)去進(jìn)行操作的。首先得先用那種不含有鈣鎂成分的磷酸鹽緩沖液輕輕地去清洗兩次，以此來(lái)除掉殘余血清對(duì)于胰蛋白酶所產(chǎn)生的抑制作用。接著加入0.05%的胰蛋白酶以及0.02%的EDTA混合液，然后在37度的環(huán)境下進(jìn)行消化1到3分鐘，在這期間還需要輕輕地去拍打培養(yǎng)瓶的，一旦看到細(xì)胞變圓并且開(kāi)始自然脫落的時(shí)候呀應(yīng)當(dāng)立刻就終止操作。傳代的比例一般而言是控制在1:2的，要是太過(guò)稀松了就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不起來(lái)，可要是太過(guò)緊密了又會(huì)加速細(xì)胞老化的進(jìn)程。傳代之后最開(kāi)始是5秒，接著是10秒后，再過(guò)15秒，直到24小時(shí)之內(nèi)都不要任何移動(dòng)放置培養(yǎng)瓶的動(dòng)作，要讓細(xì)胞能夠充分地去貼附在瓶壁之上。

原代細(xì)胞鑒定方法

需通過(guò)形態(tài)學(xué)以及標(biāo)志物檢測(cè)來(lái)確認(rèn)分離培養(yǎng)出的細(xì)胞是不是目標(biāo)類型，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形，而上皮細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石狀，進(jìn)一步能夠采用免疫熒光染色，針對(duì)細(xì)胞特異性的蛋白予以標(biāo)記，像角蛋白用于上皮細(xì)胞，波形蛋白用于成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)也能夠?qū)?xì)胞純度開(kāi)展定量分析，建議每次分離新批次之后都進(jìn)行簡(jiǎn)單鑒定，以此確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。