細胞培養(yǎng)如何避免污染

細胞培養(yǎng)時，污染乃是最為常見的致使失敗的緣由，要預(yù)防污染就得始終堅持無菌操作，在使用之前，要用百分之七十五的酒精去擦拭生物安全柜，一切耗材都要歷經(jīng)高壓滅菌或者輻照處理，進行操作之際，要身著潔凈的實驗服，戴上手套，盡可能地防止手臂橫向越過開口的容器，向培養(yǎng)基里添加百分之一的雙抗能夠抑制細菌，然而對于支原體卻沒有效果，因此需要定期運用PCR法去檢測。

倘若察覺到污染跡象，像培養(yǎng)基呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，或者pH發(fā)生變色情況，又或者細胞出現(xiàn)漂浮脫落現(xiàn)象，那就應(yīng)當(dāng)即刻將其丟棄，并且對培養(yǎng)瓶進行消毒處理。千萬別去嘗試借助抗生素來“拯救”，因為那樣做只會把問題給掩蓋住，還會滋生出耐藥菌。培養(yǎng)箱的水盤每周都要替換成無菌水，還要添加硫酸銅，以此來防止霉菌滋生。建議確立“一人一瓶”的原則，防止因交叉使用試劑而導(dǎo)致批量污染發(fā)生。

細胞培養(yǎng)傳代的最佳時機

在細胞融合度觸及80% - 90%之際傳代是最為適宜的，要是傳代過早，細胞數(shù)量少且呈現(xiàn)生長緩慢的態(tài)勢，而過晚傳代的話，會因接觸抑制致使老化或者分化的情況發(fā)生。需觀察倒置顯微鏡：看到貼壁細胞間隙消失、開始重疊之時就要展開行動。對于懸浮細胞而言，當(dāng)密度達到1×10^6個/ml的時候進行傳代，不然代謝廢物積累會對細胞活性造成毒害。

用于傳代的標(biāo)準步驟是，先把舊培養(yǎng)基吸掉，接著用預(yù)熱過的PBS清洗一到兩次，以此來去除血清殘留。之后加入胰酶，使其覆蓋細胞層，在37℃的環(huán)境中進行消化，消化時間為一到五分鐘，不同的細胞系存在的差異十分顯著，比如293T細胞僅僅需要一分鐘，而成纖維細胞則需要五分鐘。當(dāng)在顯微鏡下看到細胞變圓，并且輕輕晃動時細胞就能夠脫離時，要馬上加入含有血清的培養(yǎng)基來終止。而后用吸管輕柔地吹打十到十五次，按照1:3的比例接種到新的瓶子當(dāng)中。

細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基怎么選

要選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這取決于細胞類型。DMEM高糖型，適合那種快速增殖的HeLa、CHO細胞。而低糖型呢，適合代謝比較慢的原代成纖維細胞。RPMI - 1640是專門為懸浮細胞設(shè)計的，像淋巴細胞以及白血病細胞系就是這類。能用于神經(jīng)元、再或者上皮原代細胞的是MEM和F - 12。成本較高但是蛋白表達適宜的無血清培養(yǎng)基類為CHO - SFM。

血清一般添加10%胎牛血清，部分特殊細胞得額外補充谷氨酰胺、丙酮酸鈉或者非必需氨基酸。購買培養(yǎng)基之際優(yōu)先挑選液體成品，防止自己配制粉劑導(dǎo)致批間差以及pH波動。分裝成50ml小管存放在4℃，防止反復(fù)加熱。使用之前觀察顏色，正常酚紅指示劑呈現(xiàn)鮮紅色，偏紫或者偏黃表明pH異常，不宜再使用。