熒光探針PCR試劑盒，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)里常用的檢測(cè)工具，它借助熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增進(jìn)程，達(dá)成目標(biāo)序列的迅速定性或者定分分析，跟普通PCR相較，此方法不需要電泳步驟，操作更為便捷，結(jié)果判讀更為直觀，不管是基因表達(dá)分析，還是病原體篩查，把握試劑盒的核心要點(diǎn)，均能明顯提升實(shí)驗(yàn)效率。

原理是什么

它是熒光探針PCR試劑盒，核心為T(mén)aqMan探針或者分子信標(biāo)技術(shù)，探針兩端標(biāo)記的是熒光基團(tuán)以及淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整的時(shí)候，熒光被進(jìn)行淬滅，PCR退火的階段，探針和模板特異性結(jié)合，延伸的進(jìn)程里，Taq酶的外切酶活性切斷探針，使得熒光基團(tuán)分離進(jìn)而發(fā)出信號(hào)，每一個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度和產(chǎn)物量成正比例關(guān)系，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能夠推算產(chǎn)生了初始模板量，明白這一機(jī)制對(duì)判斷實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是不是精準(zhǔn)可靠有幫助。

操作步驟

使用熒光探針PCR試劑盒之前，要把各組分充分融化，還要進(jìn)行混勻，以此來(lái)避免反復(fù)凍融的情況。接著按照說(shuō)明書(shū)去配制反應(yīng)體系，這反應(yīng)體系一般包含預(yù)混液、探針、引物、模板以及去離子水。加樣的時(shí)候，一定要使用帶濾芯槍頭，目的是防止氣溶膠污染。在上機(jī)運(yùn)行之前，要設(shè)定好熒光通道以及循環(huán)參數(shù)，退火溫度建議先開(kāi)展梯度測(cè)試。反應(yīng)結(jié)束之后，要觀察擴(kuò)增曲線以及Ct值，陰性對(duì)照不應(yīng)該起峰，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)需要達(dá)到0.99以上。

如何選型

購(gòu)物熒光探針PCR試劑盒，要優(yōu)先考量增多效率以及測(cè)驗(yàn)靈敏度。針對(duì)低拷貝數(shù)樣本，去挑選高靈敏度的試劑盒，像檢測(cè)下限低到10 copies/反應(yīng)這樣的；要是樣本抑制物質(zhì)較多，那就需要耐抑制型配方。留意區(qū)分通用型和專(zhuān)用型，部分試劑盒針對(duì)特定序列優(yōu)化了引物探針。另外要核對(duì)儀器兼容性，不同品牌PCR儀的熒光通道波長(zhǎng)有差別，購(gòu)買(mǎi)之前一定要確認(rèn)試劑盒支持的染料類(lèi)型跟您的設(shè)備相匹配。

注意事項(xiàng)

熒光探針PCR試劑盒要保存得務(wù)必避光防潮，預(yù)混液通常在-20℃保存，要避免反復(fù)凍融超過(guò)5次。配制反應(yīng)液時(shí)應(yīng)在冰盒上開(kāi)展操作，并且每步加樣之后要更換槍頭。每次實(shí)驗(yàn)都必須設(shè)置無(wú)模板對(duì)照以及無(wú)反轉(zhuǎn)錄對(duì)照（要是用于RNA檢測(cè)）。要是擴(kuò)增曲線出現(xiàn)非特異性起峰，可能是引物二聚體或者探針降解所導(dǎo)致的，建議重新設(shè)計(jì)引物或者更換新批次試劑盒。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要及時(shí)分析數(shù)據(jù)并備份原始文件。